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        2. 生命科學
          化學
          分析
          儀器
          耗材
          質譜級賴氨酰肽鏈內切酶
          Lysyl Endopeptidase?

          質譜級賴氨酰肽鏈內切酶新品速遞圖wako.jpg

          Lysyl Endopeptidase?


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            本產品是質譜分析前處理時常用的蛋白分解酶即賴氨酰肽鏈內切酶,該酶可以特異性切除賴氨酸基團C末端的多肽,可用于蛋白測序分析和 Lys-X 化合物的酶合成。若同時使用賴氨酰肽鏈內切酶和胰酶,可更好地切斷賴氨酸基團的多肽,增加多肽的數量。產品已按照使用習慣做成小包裝,是方便使用的冷凍干燥品。20 μg/支可用于100-200個樣品的凝膠內消化。


          來源:細菌

          外觀:凍干粉(包含2 mmol/L Tris-HCl 緩沖液,pH8)

          活性:0.03~0.07 AU/vial

          分子量:27,000(瓊脂糖過濾),30,000(SDS-PAGE)

          溶解性:溶于水或緩沖液

          穩定性:溶解于 pH 值 5.0-12.0 的 Tris 緩沖液中,可在4℃穩定保存2年;在 pH 值 6.0-11.0、30℃時能穩定保存,但溫度超過50℃時不穩定。

          最適pH值:9.0~9.5

          等電點:6.9~7.0 

          底物特異性:

          可水解底物——Tos-Lys-OMe、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA

          不可水解底物——Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNA、Arg-pNA

          抑制劑:DFP、PMSF、TLCK



          特點


          ●  高特異性、高蛋白質消化率、適用于蛋白質譜分析

            提高裂解效率、增加肽段數量

            根據使用量特意制備小包裝,方便使用



          應用


            分別采用胰蛋白酶(Tp、賴氨酰肽鏈內切酶(Lys-C)和 Tp與Lys-C 聯用進行膠內酶切的效果比較。

            牛血清蛋白 BSA 的條帶(100 ng)通過 SDS-PAGE 獲得,然后分別用 Tp、Lys-C 和 Lys-C+Tp 進行酶切,再用 MALDI-TOFMS 法進行分析。

            這些蛋白酶的實驗效果見下表。


          表 1:Tp、Lys-C 和 Lys-C+Tp 的結果對照

          這些結果表明 Lys-C 酶解的錯誤裂解率最低。Tp 酶解時加入 Lys-C 后,錯誤裂解率有所降低,同時,可以鑒定出更多的多肽。



          Tp 

          Lys-C

          Lys-C+Tp

          裂解位點

          精氨酸和賴氨酸的C端 

          賴氨酸的C端 

          精氨酸和賴氨酸的C端

          錯誤裂解率

          (錯誤裂解所占比例  )

          多(8%)

          很少(0%)

          少(3%)

          鑒定出的多肽數量 

          17

          19

          22


          blob.png


          胰蛋白酶(Tp)(圖 a)和賴氨酰肽鏈內切酶(Lys-C)+Tp( 圖 b)酶切后的質譜結果對照圖。

          Lys-C+Tp 酶切后,可以在 m/z=2000 時得到吸收峰,而單獨的 Tp 酶切在 m/z=2000 時沒有吸收峰。該結果表明 Lys-C 可以提高測序覆蓋度。

           

          ( 數據由大阪醫療中心和婦嬰健康研究所Y. Wada 博士提供 )



          賴氨酰肽鏈內切酶


            賴氨酰肽鏈內切酶,最初由 Masaki 等人從土壤細菌中分離得到。該酶可以特異性剪切賴氨酸殘基C末端和S-氨乙基半胱氨酸殘基的肽鍵,用于蛋白測序和 Lys-X 化合物的酶催化合成。該酶穩定性高,在4M尿素或 0.1% SDS 溶液中 30℃ 孵育6小時之后,仍然擁有完整的生物活性。


          外觀

            凍干粉(包含ca. 10% Tris-HCl buffer,pH 8)

          活性

            見包裝

          分子量

            27,000(凝膠過濾);30,000 (SDS-PAGE)

          溶解性

            易溶于水或緩沖液

          最佳pH

            9.0-9.5(酰胺酶的最佳活性 pH)

          等電點

            6.9-7.0

          抑制劑

            DFP、PMSF、TLCK

          來源

            細菌

          穩定性

           溶于pH 值 5.0-12.0 的緩沖液中,可于4℃穩定保存。溶于pH 值 6.0-11.0 的緩沖液中,可于30℃穩

           定保存,但是50℃及以上不穩定。

          單位定義

           一單位酰胺酶(AU)指在30℃ pH 9.5 時每分鐘產生1 μmol 對硝基苯胺所需的酶量。

          底物特異性

           水解底物:Tos-Lys-Ome、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA

           非水解底物:Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNa、Arg-pNA


          實驗方法


          1試劑:

          A.0.2 mol/L AMP 緩沖液,pH值 9.5

                溶解 4.2 g 的2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇于 150 mL 的水中,加入1 mol/L HCl 調 pH 值至 9.5,再加水使體積至 200 mL。

          B.2.5 mmol/L 底物溶液

                溶解 22.6 mg 的N-苯甲?;?DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽于 20 mL 水中。

          C.   2 mmol/L Tris-HCl 緩沖液,pH8

                溶解 0.24 mg的2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇于 900 mL 水中,加入 0.1 mol/L HCl 調pH值至8,再加水使體積至1 L。

          D.   酶溶液

                溶解1vial 的賴氨酰肽鏈內切酶于1mL 的溶劑C中,可直接加入。

          E. 終止溶液

                將 55 mL 水和 45 mL 乙酸混合均勻。


           

          2. 步驟


          試劑

          檢測樣品

          空白對照

          A

          2.6 mL

          2.6 mL

          B

          0.3 mL

          0.3 mL


          30℃ 預培養5分鐘

          D

          0.1 mL

          -

          C

          -

          0.1 mL


          立即混合均勻,30℃ 預培養25分鐘

          E

          1.0 mL

          1.0 mL

           

          3. 單位的定義

          酰胺酶單位是指 30℃、pH 9.5 時,每分鐘產生1μmol 對硝基苯胺的酶量。

           

          AU/vial = [(a-b) / 25] × (1/9.62) × (4.0/0.1)

          a.    檢測樣品中的吸光度

          b.    空白對照中的吸光度

           

          膠內酶切的實驗操作流程

            用聚硅酮處理的微量離心管和吸管端防止捕獲任何蛋白。使用質譜分析用凝膠染色試劑盒,例如銀染劑 MS 試劑盒(產品編號:299-58901)和負凝膠染色 MS 試劑盒(產品編號:293-57701

          1.    電泳分離蛋白質樣品;

          2.    從凝膠中切割蛋白質片斷并放入微量離心管;

          3.    使凝膠脫色(可使用質譜分析用凝膠染色試劑盒中的脫色溶液);

          4.    加入300 μL 乙腈到試管里,攪拌器振蕩 30 分鐘;

          5.    去除乙腈,用 Parafilm 膜覆蓋微量離心管。

          6.    在 Parafilm 膜上打出針孔,真空干燥 15 分鐘;

          7.    100 μL 10 mmol/L DTT 溶解于 100 mmol/L 碳酸氫銨,56℃恒溫小時。

          8.    室溫冷卻后,用等量的 50 mM 碘乙酰胺溶解于 100 mmol/L 碳酸氫銨,暗處恒溫 45 分鐘并渦旋;

          9.    用 100 μL 100 mmol/L 碳酸氫銨洗滌凝膠片段 10 分鐘;

          10.  用 300 μL 乙腈干燥凝膠片段 15 分鐘;

          11.  用 100 μL 100 mmol/L 碳酸氫銨溶脹凝膠片段 15 分鐘;

          12.  用 300 μL 乙腈再次干燥凝膠片段 15 分鐘;

          13.  去除液相,真空干燥凝膠片段 15 分鐘;

          14.  用 100 μL 賴氨酸內切酶溶液*在冰水浴中溶脹凝膠片段 45 分鐘;

            *賴氨酸內切酶稀釋于 50 mmol/L Tris-HCl  pH 8.5;

          15.  去除 100 μL 賴氨酸內切酶溶液,將凝膠片段放在 37、10 μL 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5 中過夜;

          16.  加入 50 μL 20mmol/L 碳酸氫銨 20 分鐘內振蕩凝膠片段次抽提多肽;

          17.  加入 5% 甲酸/50% 乙腈 20 分鐘內振蕩凝膠片段次抽提多肽;

          18.  如果需要用 Speed Vac. 濃縮多肽;

          19.  用 ZipTip 脫鹽和純化多肽;

          20.  如果需要用弱真空濃縮多肽至μL;

          21.  加入基質進行質譜分析。

           

          注意:根據細菌的生理和形態特征分類,產品來源為水解無色桿菌,但是最近細菌分類學將這種細菌鑒定為產酶溶桿菌。


          保存:暗處-20℃保存

           

          規格:20 μg×5 vial



          相關產品


          產品編號產品名稱包裝應用
          202-15951

          Trypsin, from Porcine Pancreas

          Mass Spectrometry Grade

          豬胰腺胰蛋白酶質譜級別
          5×20 μg蛋白質組學
          056-05921Endoproteinase Asp-N, Sequencing grade
          胞內蛋白酶 Asp-N(測序級別)
          2 μg用于測序
          050-05941Endoproteinase Glu-C, Sequencing grade
          胞內蛋白酶 Glu-C(測序級別)
          50 μg
          164-13982V8 Protease [Endoproteinase Glu-C]
          V8蛋白酶
          2 mg生物化學



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          賴氨酰肽鏈內切酶,MS級

          產品編號:125-05061

          發表文獻


          [1]   Ojima T et al. “Characterization of Halomonas Sp. Strain H11 {alpha}-Glucosidase Activated by Monovalent Cations and Its Application for Efficient Synthesis of {alpha}-D-Glucosylglycerol.” Applied and Environmental Microbiology 78, no. 6 (March 15, 2012): 1836–1845.


          [2]   Leitner A et al. “Expanding the Chemical Cross-Linking Toolbox by the Use of Multiple Proteases and Enrichment by Size Exclusion Chromatography.”Molecular and Cellular Proteomics 11, no. 3 (March 1, 2012): M111.014126.


          [3]   Goetze A et al. “Rates and Impact of Human Antibody Glycation in Vivo.” Glycobiology 22, no. 2 (February 1, 2012): 221–234.


          [4]   Thingholm, T et al. “Characterization of Human Myotubes From Type 2 Diabetic and Nondiabetic Subjects Using Complementary Quantitative Mass Spectrometric Methods.” Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 9 (September 1, 2011): M110.006650.


          [5]    Shoji M et al. “walK and clpP Mutations Confer Reduced Vancomycin Susceptibility in Staphylococcus Aureus.” Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55, no. 8 (August 1, 2011): 3870–3881.


          [6]    Kubota T et al. “Quantitative Proteomic Analysis of Chromatin Reveals That Ctf18 Acts in the DNA Replication Checkpoint.”Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 7 (July 1, 2011): M110.005561.


          [7]   Lee E et al. “The Steady-State Repertoire of Human SCF Ubiquitin Ligase Complexes Does Not Require Ongoing Nedd8 Conjugation.” Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 5 (May 1, 2011): M110.006460.


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          [9]    Liu D et al. “N-terminal Glutamate to Pyroglutamate Conversion in Vivo for Human IgG2 Antibodies.” Journal of Biological Chemistry 286, no. 13 (April 1, 2011): 11211–11217.


          [10]    Shen H et al. “Constitutive Activated Cdc42-associated Kinase (Ack) Phosphorylation at Arrested Endocytic Clathrin-coated Pits  of Cells That Lack Dynamin.” Molecular Biology of the Cell 22, no. 4 (February 15, 2011): 493–502.


          [11]    Keinath N et al. “PAMP (Pathogen-associated Molecular Pattern)-induced Changes in Plasma Membrane Compartmentalization Reveal Novel Components of Plant Immunity.” Journal of Biological Chemistry 285, no. 50 (December 10, 2010): 39140–39149.


          [12]    Maeda T et al. “Purification, Characterization and Amino Acid Sequence of a Novel Enzyme, D-threo-3-hydroxyaspartate Dehydratase, from Delftia Sp. HT23.” Journal of Biochemistry 148, no. 6 (December 1, 2010): 705–712.


          [13]   Rajagopal C et al. “Secretion Stimulates Intramembrane Proteolysis of a Secretory Granule Membrane Enzyme.” Journal of Biological Chemistry 285, no. 45 (November 5, 2010): 34632–34642.


          [14]    Sato H et al.“Novel Isonitrile Hydratase Involved in Isonitrile Metabolism.”Journal of Biological Chemistry 285, no. 45 (November 5, 2010): 34793–34802.


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          [16]    Matsumoto T et al. “Proteomic Analysis Identifies Insulin-like Growth Factor-binding Protein-related Protein-1 as a Podocyte Product.” Renal Physiology 299, no. 4 (October 1, 2010): F776–784.


          [17]    Sury M et al. “The SILAC Fly Allows for Accurate Protein Quantification in Vivo.” Molecular and Cellular Proteomics 9, no. 10 (October 1, 2010): 2173–2183.



          產品編號 產品名稱 產品規格 產品等級
          125-05061 Lysyl?Endopeptidase?,?MS?Grade?
          賴氨酰肽鏈內切酶,MS級
          20?μg×5 質譜級
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