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        2. SuperSep Phos-tag? 蛋白磷酸化預制膠-【本活動已結束】


          【本活動已結束】


            SuperSep Phos-tag?是研究蛋白磷酸化的方法,無需特異性磷酸化抗體或者同位素標記。


          SuperSep Phos-tag?


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            Phos-tag?是一種預制膠,預先加入了50 μmol/L的Phostag? Acrylamide,打開包裝即可直接使用。預制膠中含有鋅作為金屬離子,在中心凝膠緩沖液中保存穩定性很好,得到的帶條結果也很整齊。

            磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作為不同條帶分離。

            分離后,膠可用于考馬斯亮藍染色,免疫印跡和質譜實驗。


          Phos-tag? SDS-PAGE 的原理


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          在HighWire Search 上搜索到的論文數


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          運用


          利用p35的丙氨酸突變體確定Cdk5 激活p35的磷酸化位點


            p35常見的磷酸化位點是Ser8和Thr138。但是Ser8和Thr138位點往往會發生丙氨酸突變,產生3種突變體(Ser8突變體:S8A,Thr138突變體:T138A,Ser8和Thr138雙突變體:2A)。這3種突變體、野生型p35、Cdk5和沒有激酶活性的Cdk5都來源于COS-7細胞。這些細胞裂解液用Phos-tag? SDS-PAGE和Western blotting 進行檢測(檢測抗體:p35抗體)。


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          100 μM Phos-tag ? 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝膠

          可明確磷酸化位點和條帶遷移率的關系!


          - 泳道1(條帶L2和L4)和泳道5(條帶M1):p35在Cdk5的作用下發生了磷酸化;

          - 泳道1(條帶L2和L4)和泳道3(條帶L2和L4):在無激酶活性Cdk5的作用下,大約有一半p35蛋白在Thr138位點發生磷酸化,同樣在138位發生突變的p35蛋白亦是如此。

          泳道5 (條帶M1)和泳道6(條帶L3和L4):Ser8和Thr138是主要的磷酸化位點;

          - 泳道5(條帶M1)、泳道7(條帶L1和L2)和泳道8(條帶M2):條帶M1是Ser8和Thr138都發生磷酸化的條帶;條帶M2是只有Ser8磷酸化的條帶;條帶L1和L2是只有Thr138磷酸化的條帶。

          ※ 條帶L1和L3中的X 是不確定哪個位點發生磷酸化的條帶;

          ※ 條帶L4是非磷酸化的p35。


          【參考文獻】

          Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ? SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 - 1143.

          【結果提供】

          理化學研究所 腦科學綜合研究中心 回路功能研究核心 記憶功能研究團隊 細川智永(Dr. T. Hosokawa)

          首都大學東京 理工學研究科 生命科學專業 神經分子功能研究室 久永真市(Dr. S. Hisanaga)


          檢測含有Dnmt1磷酸化激酶的片段


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          我們可以確定在片段中含有目的激酶!


          ① 采用親和色譜法從鼠腦提取液中純化GST-Dnmt1(1-290)結合蛋白

          ② 使用0.3 M 和1 M NaCl 的DNA 纖維素柱洗脫得到目的蛋白

          ③ GST-Dnmt1(1-290)作為體外激酶實驗的反應底物

                 ④ Phos-tag ? SDS-PAGE 用于Western blotting,確定遷移條帶中每個片段的激酶活性


          【參考文獻】

          The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J.,

          【結果提供】

          高知大學 綜合研究中心 生命、功能物質部門 實驗實習機器設施 杉山康憲(Dr. Y. Sugiyama)

          香川大學 農學部 應用生物科學科 動物功能生化學研究室 龜下勇(Dr. I. Kameshita)



          二維電泳中的應用:分析hnRNP K磷酸化異構體


            小鼠巨噬細胞J774.1 經LPS 刺激后,裂解細胞,經過免疫沉淀法分離得到hnRNP K。在二維電泳中,一維是IPG 膠,二維是Phos-tag ? SDS-PAGE,可分離hnRNP K 的異構體。利用質譜儀,可以確認不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白。


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          同一個等電點的位置上,不同位點發生磷酸化都可以被區分開來

          (例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7)


          【參考文獻】

          Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.

          【結果提供】

          橫濱市立大學 生命納米系統科學研究科 生物體超分子系統科學專業 木村彌生(Dr. Y. Kimura)、平野久(Dr. H. Hirano)

          理化學研究所RCAI 小原收



          備注


          樣品制備:

          Phos-tag SDS-PAGE對于蛋白樣品中的雜質非常敏感,尤其是螯合劑,釩酸,無機鹽,表面活性劑這類物質。

          強烈建議在Phos-tag SDS-PAGE之前通過TCA沉淀或滲析法降低雜質含量。


          轉膜前處理:

          另一個必須的步驟是在轉膜前,用EDTA去除凝膠中的金屬離子(Mn2+或者Zn2+);

          該步驟可提高蛋白的轉膜效率。

          ● 分別準備10 mmol/L 含EDTA和不含EDTA 兩種1x transfer buffer。

          ● 將凝膠浸泡在含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer,至少20分鐘,溫和搖晃。更換新緩沖液,重復3次。

          ● 將凝膠浸泡在不含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer,10分鐘,溫和搖晃。

          ● 轉膜操作*。

          * 建議用濕法轉膜,以提高轉膜效率。


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          質量控制


            每一批SuperSep Phos-tag?,出廠前均根據其產品規格進行測試,以保證可分離磷酸化和非磷酸化蛋白,以及他們的分離成都在正常參數內。


          ◆產品信息


          產品編號
          產品名稱
          規格
          192-18001-EA-S

          SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm

          Phos-tag 預制膠50μmol/l,7.5%,17孔,Life Technologies型

          1塊
          198-17981-EA-S

          SuperSep? Phos-tag? (50μmol/l), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm

          Phos-tag 預制膠50μmol/l,7.5%,17孔,BioRad型

          1塊


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